Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Používate verziu prehliadača s obmedzenou podporou CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Okrem toho, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, zobrazujeme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Zobrazuje karusel troch snímok naraz.Pomocou tlačidiel Predchádzajúci a Ďalší sa môžete pohybovať po troch snímkach naraz alebo pomocou posúvacích tlačidiel na konci môžete prechádzať tromi snímkami naraz.
S vývojom nových ultramäkkých materiálov pre medicínske zariadenia a biomedicínske aplikácie je komplexná charakterizácia ich fyzikálnych a mechanických vlastností dôležitá a zároveň náročná.Na charakterizáciu extrémne nízkeho povrchového modulu novej biomimetickej silikón-hydrogélovej kontaktnej šošovky lehfilcon A potiahnutej vrstvou štruktúr rozvetvených polymérnych kefiek sa použila modifikovaná nanoindentačná technika mikroskopie atómovej sily (AFM).Táto metóda umožňuje presné určenie kontaktných bodov bez účinkov viskóznej extrúzie pri približovaní sa k rozvetveným polymérom.Okrem toho umožňuje určiť mechanické charakteristiky jednotlivých prvkov kefky bez vplyvu poroelasticity.To sa dosiahne výberom sondy AFM s dizajnom (veľkosť hrotu, geometria a tuhosť pružiny), ktorý je vhodný najmä na meranie vlastností mäkkých materiálov a biologických vzoriek.Táto metóda zlepšuje citlivosť a presnosť pre presné meranie veľmi mäkkého materiálu lehfilcon A, ktorý má extrémne nízky modul pružnosti na povrchu (do 2 kPa) a extrémne vysokú elasticitu vo vnútornom (takmer 100 %) vodnom prostredí. .Výsledky povrchovej štúdie odhalili nielen vlastnosti ultramäkkého povrchu šošovky lehfilcon A, ale tiež ukázali, že modul štetcov z rozvetveného polyméru bol porovnateľný s modulom silikónovo-vodíkového substrátu.Táto technika charakterizácie povrchu môže byť aplikovaná na iné ultramäkké materiály a zdravotnícke pomôcky.
Mechanické vlastnosti materiálov určených na priamy kontakt so živým tkanivom sú často dané biologickým prostredím.Dokonalá zhoda týchto vlastností materiálu pomáha dosiahnuť požadované klinické charakteristiky materiálu bez spôsobenia nežiaducich bunkových reakcií1,2,3.Pre objemové homogénne materiály je charakterizácia mechanických vlastností relatívne jednoduchá vďaka dostupnosti štandardných postupov a testovacích metód (napr. mikroindentácia4,5,6).Avšak pre ultramäkké materiály, ako sú gély, hydrogély, biopolyméry, živé bunky atď., tieto testovacie metódy nie sú vo všeobecnosti použiteľné z dôvodu obmedzení rozlíšenia merania a nehomogenity niektorých materiálov7.Tradičné metódy vtláčania boli v priebehu rokov modifikované a prispôsobené tak, aby charakterizovali širokú škálu mäkkých materiálov, ale mnohé metódy stále trpia vážnymi nedostatkami, ktoré obmedzujú ich použitie8,9,10,11,12,13.Nedostatok špecializovaných testovacích metód, ktoré dokážu presne a spoľahlivo charakterizovať mechanické vlastnosti supermäkkých materiálov a povrchových vrstiev výrazne obmedzuje ich použitie v rôznych aplikáciách.
V našej predchádzajúcej práci sme predstavili kontaktné šošovky lehfilcon A (CL), mäkký heterogénny materiál so všetkými ultramäkkými povrchovými vlastnosťami odvodenými z potenciálne biomimetických vzorov inšpirovaných povrchom rohovky oka.Tento biomateriál bol vyvinutý naočkovaním rozvetvenej, zosieťovanej polymérnej vrstvy poly(2-metakryloyloxyetylfosforylcholínu (MPC)) (PMPC) na silikónový hydrogél (SiHy) 15 určený pre zdravotnícke pomôcky na báze.Tento proces vrúbľovania vytvára na povrchu vrstvu pozostávajúcu z veľmi mäkkej a vysoko elastickej rozvetvenej polymérnej štruktúry štetca.Naša predchádzajúca práca potvrdila, že biomimetická štruktúra lehfilconu A CL poskytuje vynikajúce povrchové vlastnosti, ako je zlepšená prevencia zmáčania a zanášania, zvýšená lubricita a znížená bunková a bakteriálna adhézia15,16.Okrem toho použitie a vývoj tohto biomimetického materiálu tiež naznačuje ďalšie rozšírenie na ďalšie biomedicínske zariadenia.Preto je dôležité charakterizovať povrchové vlastnosti tohto ultramäkkého materiálu a pochopiť jeho mechanickú interakciu s okom, aby sa vytvorila komplexná vedomostná základňa na podporu budúceho vývoja a aplikácií.Väčšina komerčne dostupných SiHy kontaktných šošoviek je zložená z homogénnej zmesi hydrofilných a hydrofóbnych polymérov, ktoré tvoria jednotnú štruktúru materiálu17.Uskutočnilo sa niekoľko štúdií na skúmanie ich mechanických vlastností pomocou tradičných testovacích metód kompresie, ťahu a mikroindentácie18,19,20,21.Avšak nový biomimetický dizajn lehfilconu A CL z neho robí jedinečný heterogénny materiál, v ktorom sa mechanické vlastnosti štruktúr rozvetvených polymérnych kefiek výrazne líšia od vlastností základného substrátu SiHy.Preto je veľmi ťažké presne kvantifikovať tieto vlastnosti pomocou konvenčných a indentačných metód.Sľubná metóda využíva metódu testovania nanoindentácie implementovanú v mikroskopii atómovej sily (AFM), metódu, ktorá sa používa na stanovenie mechanických vlastností mäkkých viskoelastických materiálov, ako sú biologické bunky a tkanivá, ako aj mäkkých polymérov22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.V nanoindentácii AFM sú základy testovania nanoindentácie kombinované s najnovšími pokrokmi v technológii AFM, aby sa zabezpečila zvýšená citlivosť merania a testovanie širokej škály prirodzene supermäkkých materiálov31,32,33,34,35,36.Okrem toho táto technológia ponúka ďalšie dôležité výhody vďaka použitiu rôznych geometrií.indentor a sonda a možnosť testovania v rôznych tekutých médiách.
AFM nanoindentáciu možno podmienečne rozdeliť do troch hlavných komponentov: (1) vybavenie (senzory, detektory, sondy atď.);(2) parametre merania (ako je sila, posun, rýchlosť, veľkosť rampy atď.);(3) Spracovanie údajov (korekcia základnej línie, odhad bodu dotyku, prispôsobenie údajov, modelovanie atď.).Významným problémom tejto metódy je, že niekoľko štúdií v literatúre s použitím nanoindentácie AFM uvádza veľmi odlišné kvantitatívne výsledky pre rovnaký typ vzorky/bunky/materiálu37,38,39,40,41.Napríklad Lekka a spol.Bol študovaný a porovnávaný vplyv geometrie AFM sondy na nameraný Youngov modul vzoriek mechanicky homogénneho hydrogélu a heterogénnych buniek.Uvádzajú, že hodnoty modulu sú vysoko závislé od výberu konzoly a tvaru hrotu, pričom najvyššia hodnota je pre sondu v tvare pyramídy a najnižšia hodnota je 42 pre sférickú sondu.Podobne Selhuber-Unkel a kol.Ukázalo sa, ako rýchlosť indentora, veľkosť indentoru a hrúbka vzoriek polyakrylamidu (PAAM) ovplyvňujú Youngov modul meraný nanoindentáciou ACM43.Ďalším komplikujúcim faktorom je nedostatok štandardných testovacích materiálov s extrémne nízkym modulom a bezplatných testovacích postupov.Preto je veľmi ťažké získať presné výsledky s istotou.Metóda je však veľmi užitočná na relatívne merania a porovnávacie hodnotenia medzi podobnými typmi vzoriek, napríklad pomocou AFM nanoindentácie na rozlíšenie normálnych buniek od rakovinových buniek44,45.
Pri testovaní mäkkých materiálov pomocou nanoindentácie AFM je všeobecným pravidlom použiť sondu s nízkou konštantou pružiny (k), ktorá sa tesne zhoduje s modulom vzorky, a pologuľovitým/okrúhlym hrotom, aby prvá sonda neprepichla povrchy vzorky na prvý kontakt s mäkkými materiálmi.Je tiež dôležité, aby signál vychýlenia generovaný sondou bol dostatočne silný na to, aby bol detekovaný systémom laserového detektora24,34,46,47.V prípade ultramäkkých heterogénnych buniek, tkanív a gélov je ďalšou výzvou prekonať adhéznu silu medzi sondou a povrchom vzorky, aby sa zabezpečili reprodukovateľné a spoľahlivé merania48,49,50.Až donedávna sa väčšina prác na AFM nanoindentácii zameriavala na štúdium mechanického správania biologických buniek, tkanív, gélov, hydrogélov a biomolekúl pomocou relatívne veľkých sférických sond, bežne označovaných ako koloidné sondy (CPs)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Tieto hroty majú polomer 1 až 50 µm a sú bežne vyrobené z borosilikátového skla, polymetylmetakrylátu (PMMA), polystyrénu (PS), oxidu kremičitého (SiO2) a diamantu. ako uhlík (DLC).Hoci nanoindentácia CP-AFM je často prvou voľbou pre charakterizáciu mäkkých vzoriek, má svoje vlastné problémy a obmedzenia.Použitie veľkých guľovitých hrotov s mikrónovou veľkosťou zvyšuje celkovú kontaktnú plochu hrotu so vzorkou a vedie k významnej strate priestorového rozlíšenia.Pre mäkké, nehomogénne vzorky, kde sa mechanické vlastnosti lokálnych prvkov môžu výrazne líšiť od priemeru na širšom území, môže CP indentácia zakryť akúkoľvek nehomogenitu vlastností v lokálnom meradle52.Koloidné sondy sa zvyčajne vyrábajú pripevnením koloidných guľôčok s mikrónovou veľkosťou k bezhrotovým konzolám pomocou epoxidových lepidiel.Samotný výrobný proces je plný mnohých problémov a môže viesť k nezrovnalostiam v procese kalibrácie sondy.Okrem toho veľkosť a hmotnosť koloidných častíc priamo ovplyvňuje hlavné kalibračné parametre konzoly, ako je rezonančná frekvencia, tuhosť pružiny a citlivosť na vychýlenie56,57,58.Bežne používané metódy pre konvenčné sondy AFM, ako je kalibrácia teploty, teda nemusia poskytovať presnú kalibráciu pre CP a na vykonanie týchto korekcií môžu byť potrebné iné metódy57, 59, 60, 61. Typické experimenty s vrúbkovaním CP používajú veľké odchýlky na konzole. študovať vlastnosti mäkkých vzoriek, čo vytvára ďalší problém pri kalibrácii nelineárneho správania konzoly pri relatívne veľkých odchýlkach62,63,64.Moderné metódy indentácie koloidnej sondy zvyčajne berú do úvahy geometriu konzoly použitej na kalibráciu sondy, ale ignorujú vplyv koloidných častíc, čo vytvára ďalšiu neistotu v presnosti metódy38,61.Podobne moduly pružnosti vypočítané prispôsobením kontaktného modelu sú priamo závislé od geometrie vtlačovacej sondy a nesúlad medzi charakteristikami povrchu hrotu a vzorky môže viesť k nepresnostiam27, 65, 66, 67, 68. Niektoré nedávne práce Spencera a kol.Faktory, ktoré by sa mali brať do úvahy pri charakterizácii mäkkých polymérových kefiek pomocou metódy nanoindentácie CP-AFM, sú zvýraznené.Uviedli, že zadržiavanie viskóznej tekutiny v polymérových kefkách ako funkcia rýchlosti má za následok zvýšenie zaťaženia hlavy, a teda rôzne merania vlastností závislých od rýchlosti30, 69, 70, 71.
V tejto štúdii sme charakterizovali povrchový modul ultramäkkého vysoko elastického materiálu lehfilcon A CL pomocou modifikovanej nanoindentačnej metódy AFM.Vzhľadom na vlastnosti a novú štruktúru tohto materiálu je rozsah citlivosti tradičnej indentačnej metódy jednoznačne nedostatočný na charakterizáciu modulu tohto extrémne mäkkého materiálu, preto je potrebné použiť AFM nanoindentačnú metódu s vyššou citlivosťou a nižšou citlivosťou.úrovni.Po preskúmaní nedostatkov a problémov existujúcich techník nanoindentácie koloidnej AFM sondy ukážeme, prečo sme si vybrali menšiu, na mieru navrhnutú AFM sondu na elimináciu citlivosti, šumu pozadia, presného bodu kontaktu, merania modulov rýchlosti mäkkých heterogénnych materiálov, ako je zadržiavanie tekutín. závislosť.a presné vyčíslenie.Okrem toho sme boli schopní presne zmerať tvar a rozmery hrotu, čo nám umožnilo použiť model kužeľovej gule na určenie modulu pružnosti bez hodnotenia kontaktnej plochy hrotu s materiálom.Dva implicitné predpoklady, ktoré sú v tejto práci kvantifikované, sú vlastnosti plne elastického materiálu a modul nezávislý od hĺbky vtlačenia.Pomocou tejto metódy sme najprv testovali ultramäkké štandardy so známym modulom na kvantifikáciu metódy a potom sme túto metódu použili na charakterizáciu povrchov dvoch rôznych materiálov kontaktných šošoviek.Očakáva sa, že tento spôsob charakterizácie nanoindentačných povrchov AFM so zvýšenou citlivosťou bude použiteľný pre širokú škálu biomimetických heterogénnych ultramäkkých materiálov s potenciálnym využitím v medicínskych zariadeniach a biomedicínskych aplikáciách.
Pre nanoindentačné experimenty boli vybrané kontaktné šošovky Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) a ich silikón-hydrogélové substráty.V experimente bol použitý špeciálne navrhnutý držiak objektívu.Na inštaláciu šošovky na testovanie bola opatrne umiestnená na kupolovitý stojan, pričom sa zabezpečilo, že sa dovnútra nedostali žiadne vzduchové bubliny, a potom bola pripevnená okrajmi.Otvor v upevnení v hornej časti držiaka šošovky poskytuje prístup k optickému stredu šošovky na experimenty s nanoindentáciou, pričom kvapalinu drží na mieste.Vďaka tomu sú šošovky plne hydratované.Ako testovací roztok sa použilo 500 μl roztoku na balenie kontaktných šošoviek.Na overenie kvantitatívnych výsledkov sa komerčne dostupné neaktivované polyakrylamidové (PAAM) hydrogély pripravili z polyakrylamid-ko-metylén-bisakrylamidovej kompozície (100 mm Petrisoft Petriho misky, Matrigen, Irvine, CA, USA), známy modul pružnosti 1 kPa.Použite 4-5 kvapiek (približne 125 µl) fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS od Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) a 1 kvapku roztoku OPTI-FREE Puremoist na kontaktné šošovky (Alcon, Vaud, TX, USA).) na rozhraní AFM hydrogél-sonda.
Vzorky substrátov Lehfilcon A CL a SiHy boli vizualizované pomocou systému FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) vybaveného detektorom Scanning Transmission Electron Microscope (STEM).Na prípravu vzoriek sa šošovky najskôr umyli vodou a narezali na kliny v tvare koláča.Na dosiahnutie rozdielneho kontrastu medzi hydrofilnou a hydrofóbnou zložkou vzoriek bol ako farbivo použitý 0,10% stabilizovaný roztok RuO4, do ktorého boli vzorky ponorené na 30 min.Farbenie lehfilcon A CL RuO4 je dôležité nielen na dosiahnutie zlepšeného diferenciálneho kontrastu, ale tiež pomáha zachovať štruktúru rozvetvených polymérových štetcov v ich pôvodnej podobe, ktoré sú potom viditeľné na snímkach STEM.Potom sa premyli a dehydratovali v sérii zmesí etanol/voda so zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu.Vzorky sa potom odliali s EMBed 812/aralditovým epoxidom, ktorý vytvrdzoval cez noc pri 70 °C.Vzorové bloky získané polymerizáciou živice boli narezané ultramikrotómom a výsledné tenké rezy boli vizualizované detektorom STEM v režime nízkeho vákua pri akceleračnom napätí 30 kV.Rovnaký systém SEM sa použil na podrobnú charakterizáciu sondy PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).SEM snímky sondy AFM boli získané v typickom vysoko vákuovom režime s urýchľovacím napätím 30 kV.Získajte snímky v rôznych uhloch a zväčšeniach, aby ste zaznamenali všetky detaily tvaru a veľkosti hrotu sondy AFM.Všetky rozmery hrotu, ktoré nás zaujímali na obrázkoch, boli merané digitálne.
Mikroskop atómovej sily Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) s režimom „PeakForce QNM in Fluid“ sa použil na vizualizáciu a nanoindentáciu vzoriek hydrogélu lehfilcon A CL, SiHy a PAAm.Na zobrazovacie experimenty sa použila sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) s nominálnym polomerom hrotu 1 nm na zachytenie obrázkov vzorky s vysokým rozlíšením pri rýchlosti skenovania 0,50 Hz.Všetky snímky boli urobené vo vodnom roztoku.
Experimenty s nanoindentáciou AFM sa uskutočnili pomocou sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).Sonda AFM má silikónový hrot na nitridovej konzole s hrúbkou 345 nm, dĺžkou 54 µm a šírkou 4,5 µm s rezonančnou frekvenciou 45 kHz.Je špeciálne navrhnutý na charakterizáciu a vykonávanie kvantitatívnych nanomechanických meraní na mäkkých biologických vzorkách.Senzory sú individuálne kalibrované vo výrobe s predkalibrovanými nastaveniami pružín.Pružinové konštanty sond použitých v tejto štúdii boli v rozsahu 0,05–0,1 N/m.Na presné určenie tvaru a veľkosti hrotu bola sonda podrobne charakterizovaná pomocou SEM.Na obr.Obrázok la zobrazuje skenovací elektrónový mikrosnímok s vysokým rozlíšením a malým zväčšením sondy PFQNM-LC-A-CAL, ktorý poskytuje holistický pohľad na dizajn sondy.Na obr.1b znázorňuje zväčšený pohľad na vrch hrotu sondy, poskytujúci informácie o tvare a veľkosti hrotu.Na extrémnom konci je ihla pologuľa s priemerom asi 140 nm (obr. 1c).Pod tým sa hrot zužuje do kužeľovitého tvaru a dosahuje nameranú dĺžku približne 500 nm.Mimo zužujúcej sa oblasti je hrot valcový a končí v celkovej dĺžke hrotu 1,18 um.Toto je hlavná funkčná časť hrotu sondy.Okrem toho sa na testovanie ako koloidná sonda použila aj veľká guľová polystyrénová (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) s priemerom hrotu 45 µm a pružinovou konštantou 2 N/m.so sondou PFQNM-LC-A-CAL 140 nm na porovnanie.
Bolo hlásené, že kvapalina môže byť zachytená medzi AFM sondou a štruktúrou polymérovej kefy počas nanoindentácie, ktorá bude pôsobiť smerom nahor na sondu AFM predtým, ako sa skutočne dotkne povrchu69.Tento efekt viskóznej extrúzie v dôsledku zadržiavania tekutín môže zmeniť zdanlivý bod kontaktu, a tým ovplyvniť merania povrchového modulu.Na štúdium vplyvu geometrie sondy a rýchlosti vtláčania na zadržiavanie tekutín boli vynesené krivky sily vtlačovania pre vzorky lehfilcon A CL s použitím sondy s priemerom 140 nm pri konštantných rýchlostiach posunu 1 um/sa 2 um/s.priemer sondy 45 µm, nastavenie pevnej sily 6 nN dosiahnuté pri 1 µm/s.Experimenty so sondou s priemerom 140 nm sa uskutočňovali pri rýchlosti vtláčania 1 µm/sa nastavenej sile 300 pN, zvolenej tak, aby vytvorila kontaktný tlak vo fyziologickom rozsahu (1–8 kPa) horného viečka.tlak 72. Mäkké hotové vzorky hydrogélu PAA s tlakom 1 kPa boli testované na vtlačovaciu silu 50 pN pri rýchlosti 1 μm/s pomocou sondy s priemerom 140 nm.
Keďže dĺžka kužeľovej časti hrotu sondy PFQNM-LC-A-CAL je približne 500 nm, pre akúkoľvek hĺbku vtlačenia < 500 nm možno bezpečne predpokladať, že geometria sondy počas indentácie zostane verná svojej tvar kužeľa.Okrem toho sa predpokladá, že povrch testovaného materiálu bude vykazovať reverzibilnú elastickú odozvu, čo bude tiež potvrdené v nasledujúcich častiach.Preto sme v závislosti od tvaru a veľkosti hrotu vybrali na spracovanie našich experimentov s nanoindentáciou AFM (NanoScope) model kužeľovej gule vyvinutý Briscoe, Sebastianom a Adamsom, ktorý je dostupný v softvéri dodávateľa.Softvér na analýzu údajov o separácii, Bruker) 73. Model opisuje vzťah sily a posunutia F(δ) pre kužeľ so sférickým vrcholovým defektom.Na obr.Obrázok 2 znázorňuje kontaktnú geometriu počas interakcie tuhého kužeľa s guľovým hrotom, kde R je polomer guľového hrotu, a je kontaktný polomer, b je kontaktný polomer na konci guľového hrotu, δ je kontaktný polomer.hĺbka vtlačenia, θ je polovičný uhol kužeľa.SEM obrázok tejto sondy jasne ukazuje, že guľový hrot s priemerom 140 nm sa tangenciálne spája do kužeľa, takže tu b je definované iba prostredníctvom R, tj b = R cos θ.Softvér dodaný predajcom poskytuje vzťah kužeľ-guľa na výpočet hodnôt Youngovho modulu (E) z údajov o separácii síl za predpokladu a > b.Vzťah:
kde F je indentačná sila, E je Youngov modul, ν je Poissonov koeficient.Kontaktný polomer a možno odhadnúť pomocou:
Schéma kontaktnej geometrie tuhého kužeľa s guľovým hrotom zalisovaným do materiálu kontaktnej šošovky Lefilcon s povrchovou vrstvou z rozvetvených polymérových kefiek.
Ak a ≤ b, vzťah sa redukuje na rovnicu pre konvenčný sférický indentor;
Veríme, že interakcia vrúbkovacej sondy s rozvetvenou štruktúrou polymérovej kefy PMPC spôsobí, že kontaktný polomer a bude väčší ako guľový kontaktný polomer b.Preto sme pre všetky kvantitatívne merania modulu pružnosti vykonané v tejto štúdii použili závislosť získanú pre prípad a > b.
Ultramäkké biomimetické materiály študované v tejto štúdii boli komplexne zobrazené pomocou skenovacej transmisnej elektrónovej mikroskopie (STEM) prierezu vzorky a mikroskopie atómovej sily (AFM) povrchu.Táto podrobná charakterizácia povrchu bola vykonaná ako rozšírenie našej predtým publikovanej práce, v ktorej sme určili, že dynamicky rozvetvená polymérna kefová štruktúra povrchu lehfilcon A CL modifikovaného PMPC vykazovala podobné mechanické vlastnosti ako natívne tkanivo rohovky 14 .Z tohto dôvodu označujeme povrchy kontaktných šošoviek ako biomimetické materiály14.Na obr.3a, b znázorňujú prierezy rozvetvených PMPC polymérnych kefových štruktúr na povrchu lehfilcon A CL substrátu a neošetreného SiHy substrátu, v danom poradí.Povrchy oboch vzoriek boli ďalej analyzované pomocou snímok AFM s vysokým rozlíšením, čo ďalej potvrdilo výsledky STEM analýzy (obr. 3c, d).Celkovo tieto obrázky poskytujú približnú dĺžku štruktúry rozvetvenej polymérnej kefy PMPC pri 300–400 nm, čo je rozhodujúce pre interpretáciu nanoindentačných meraní AFM.Ďalším kľúčovým pozorovaním odvodeným z obrázkov je, že celková povrchová štruktúra biomimetického materiálu CL je morfologicky odlišná od štruktúry substrátového materiálu SiHy.Tento rozdiel v morfológii ich povrchu sa môže prejaviť pri ich mechanickej interakcii s vtlačovacou AFM sondou a následne v nameraných hodnotách modulu.
Prierezové obrazy STEM (a) lehfilcon A CL a (b) substrátu SiHy.Mierka, 500 nm.AFM snímky povrchu substrátu lehfilcon A CL (c) a základného substrátu SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinšpirované polyméry a štruktúry polymérových kefiek sú vo svojej podstate mäkké a boli široko študované a používané v rôznych biomedicínskych aplikáciách74,75,76,77.Preto je dôležité použiť metódu nanoindentácie AFM, ktorá dokáže presne a spoľahlivo zmerať ich mechanické vlastnosti.Ale zároveň jedinečné vlastnosti týchto ultramäkkých materiálov, ako je extrémne nízky modul pružnosti, vysoký obsah kvapaliny a vysoká elasticita, často sťažujú výber správneho materiálu, tvaru a tvaru vtlačovacej sondy.veľkosť.To je dôležité, aby indentor neprepichol mäkký povrch vzorky, čo by viedlo k chybám pri určovaní bodu kontaktu s povrchom a oblasti kontaktu.
Na to je nevyhnutné komplexné pochopenie morfológie ultramäkkých biomimetických materiálov (lehfilcon A CL).Informácie o veľkosti a štruktúre štetcov z rozvetveného polyméru získané pomocou zobrazovacej metódy poskytujú základ pre mechanickú charakterizáciu povrchu pomocou nanoindentačných techník AFM.Namiesto sférických koloidných sond s mikrónovou veľkosťou sme zvolili sondu z nitridu kremíka PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s priemerom hrotu 140 nm, špeciálne navrhnutú na kvantitatívne mapovanie mechanických vlastností biologických vzoriek 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Zdôvodnenie použitia relatívne ostrých sond v porovnaní s konvenčnými koloidnými sondami možno vysvetliť štrukturálnymi vlastnosťami materiálu.Porovnaním veľkosti hrotu sondy (~140 nm) s rozvetvenými polymérovými kefami na povrchu CL lehfilcon A, znázornenými na obr. 3a, je možné dospieť k záveru, že hrot je dostatočne veľký na to, aby prišiel do priameho kontaktu s týmito kefovými štruktúrami, ktoré znižuje možnosť prepichnutia hrotu cez ne.Na ilustráciu tohto bodu, na obr. 4 je STEM obraz lehfilconu A CL a vrúbkovaný hrot AFM sondy (nakreslený v mierke).
Schéma zobrazujúca STEM snímku lehfilconu A CL a indentačnej sondy ACM (nakreslená v mierke).
Okrem toho je veľkosť hrotu 140 nm dostatočne malá na to, aby sa predišlo riziku akýchkoľvek lepkavých extrúznych účinkov, ktoré boli predtým uvedené pre polymérové ​​kefky vyrobené metódou nanoindentácie CP-AFM69,71.Predpokladáme, že vzhľadom na špeciálny kužeľovo-sférický tvar a relatívne malú veľkosť tohto AFM hrotu (obr. 1), povaha siločiarovej krivky generovanej nanoindentáciou lehfilcon A CL nebude závisieť od rýchlosti vtláčania alebo rýchlosti nakladania/vykladania. .Preto nie je ovplyvnená poroelastickými účinkami.Na testovanie tejto hypotézy boli vzorky lehfilcon A CL odsadené pri pevnej maximálnej sile pomocou sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale pri dvoch rôznych rýchlostiach, a výsledné krivky ťahovej a sťahovacej sily sa použili na vykreslenie sily (nN) v separácii (um) je znázornené na obrázku 5a.Je zrejmé, že silové krivky počas nakladania a vykladania sa úplne prekrývajú a neexistuje žiadny jasný dôkaz, že šmyková sila pri nulovej hĺbke vtlačenia sa na obrázku zvyšuje s rýchlosťou vtlačenia, čo naznačuje, že jednotlivé prvky kefky boli charakterizované bez poroelastického efektu.Na rozdiel od toho, účinky zadržiavania tekutín (viskózna extrúzia a efekty poroelasticity) sú zrejmé pre sondu AFM s priemerom 45 um pri rovnakej rýchlosti vtláčania a sú zvýraznené hysterézou medzi krivkami natiahnutia a stiahnutia, ako je znázornené na obrázku 5b.Tieto výsledky podporujú hypotézu a naznačujú, že sondy s priemerom 140 nm sú dobrou voľbou na charakterizáciu takýchto mäkkých povrchov.
lehfilcon A CL krivky sily vtlačenia pomocou ACM;a) použitím sondy s priemerom 140 nm pri dvoch rýchlostiach zaťaženia, čo demonštruje absenciu poroelastického efektu počas vtláčania povrchu;(b) použitím sond s priemerom 45 um a 140 nm.s ukazujú účinky viskóznej extrúzie a poroelasticity pre veľké sondy v porovnaní s menšími sondami.
Na charakterizáciu ultramäkkých povrchov musia mať metódy nanoindentácie AFM najlepšiu sondu na štúdium vlastností študovaného materiálu.Okrem tvaru a veľkosti hrotu hrá dôležitú úlohu pri určovaní presnosti a spoľahlivosti nanoindentácie aj citlivosť systému detektorov AFM, citlivosť na vychýlenie hrotu v testovacom prostredí a tuhosť konzoly.merania.Pre náš systém AFM je limit detekcie detektora polohy (PSD) približne 0,5 mV a je založený na predkalibrovanej rýchlosti pruženia a vypočítanej citlivosti na vychýlenie tekutiny sondy PFQNM-LC-A-CAL, ktorá zodpovedá teoretická citlivosť na zaťaženie.je menej ako 0,1 pN.Preto táto metóda umožňuje meranie minimálnej vtláčacej sily ≤ 0,1 pN bez akejkoľvek zložky periférneho hluku.Pre systém AFM je však takmer nemožné znížiť periférny hluk na túto úroveň v dôsledku faktorov, ako sú mechanické vibrácie a dynamika tekutín.Tieto faktory obmedzujú celkovú citlivosť metódy nanoindentácie AFM a tiež vedú k signálu šumu pozadia približne ≤ 10 pN.Na charakterizáciu povrchu boli vzorky substrátu lehfilcon A CL a SiHy vtlačené za úplne hydratovaných podmienok pomocou 140 nm sondy na charakterizáciu SEM a výsledné krivky sily boli superponované medzi silou (pN) a tlakom.Separačný graf (um) je znázornený na obrázku 6a.V porovnaní so základným substrátom SiHy silová krivka lehfilcon A CL jasne ukazuje prechodnú fázu začínajúcu v mieste kontaktu s vidlicovou polymérovou kefou a končiacu prudkou zmenou v kontakte hrotu s podložným materiálom.Táto prechodná časť silovej krivky zvýrazňuje skutočne elastické správanie rozvetvenej polymérovej kefy na povrchu, o čom svedčí kompresná krivka tesne sledujúca krivku napätia a kontrast mechanických vlastností medzi štruktúrou kefky a objemným SiHy materiálom.Pri porovnaní lefilconu.Separácia priemernej dĺžky rozvetvenej polymérovej kefy na STEM obrázku PCS (obr. 3a) a jej siločiarovej krivky pozdĺž úsečky na obr. 3a.6a ukazuje, že metóda je schopná detegovať špičku a rozvetvený polymér dosahujúci samý vrch povrchu.Kontakt medzi štruktúrami kefy.Okrem toho tesné prekrytie kriviek sily nenaznačuje žiadny účinok zadržiavania kvapaliny.V tomto prípade neexistuje absolútne žiadna adhézia medzi ihlou a povrchom vzorky.Najvyššie časti kriviek sily pre dve vzorky sa prekrývajú, čo odráža podobnosť mechanických vlastností materiálov substrátu.
a) krivky nanoindentačnej sily AFM pre substráty lehfilcon A CL a substráty SiHy, b) krivky sily zobrazujúce odhad kontaktného bodu pomocou metódy prahu hluku pozadia.
Aby bolo možné študovať jemnejšie detaily krivky sily, krivka napätia vzorky lehfilcon A CL sa znova nakreslí na obr. 6b s maximálnou silou 50 pN pozdĺž osi y.Tento graf poskytuje dôležité informácie o pôvodnom šume pozadia.Hluk je v rozsahu ±10 pN, čo sa používa na presné určenie bodu kontaktu a výpočet hĺbky vtlačenia.Ako sa uvádza v literatúre, identifikácia kontaktných bodov je rozhodujúca pre presné posúdenie vlastností materiálu, ako je modul85.Prístup zahŕňajúci automatické spracovanie údajov o sile krivky ukázal lepší súlad medzi prispôsobením údajov a kvantitatívnymi meraniami pre mäkké materiály86.V tejto práci je náš výber styčných bodov pomerne jednoduchý a objektívny, má však svoje obmedzenia.Náš konzervatívny prístup k určovaniu bodu kontaktu môže viesť k mierne nadhodnoteným hodnotám modulu pre menšie hĺbky vtlačenia (< 100 nm).Použitie detekcie dotykových bodov založenej na algoritme a automatizované spracovanie údajov by mohlo byť pokračovaním tejto práce v budúcnosti na ďalšie zlepšenie našej metódy.Takže pre vlastný šum pozadia rádovo ± 10 pN definujeme kontaktný bod ako prvý dátový bod na osi x na obrázku 6b s hodnotou ≥ 10 pN.Potom, v súlade s prahom šumu 10 pN, vertikálna čiara na úrovni ~0,27 µm označuje bod kontaktu s povrchom, po ktorom krivka napínania pokračuje, kým substrát nedosiahne hĺbku vtlačenia ~270 nm.Je zaujímavé, že na základe veľkosti prvkov rozvetvenej polymérovej kefy (300–400 nm) meranej pomocou zobrazovacej metódy je hĺbka vtlačenia vzorky CL lehfilcon A pozorovaná pomocou metódy prahu šumu pozadia približne 270 nm, čo je veľmi blízko k veľkosť merania pomocou STEM.Tieto výsledky ďalej potvrdzujú kompatibilitu a použiteľnosť tvaru a veľkosti hrotu sondy AFM na indentáciu tejto veľmi mäkkej a vysoko elastickej štruktúry rozvetvenej polymérovej kefky.Tieto údaje tiež poskytujú silné dôkazy na podporu našej metódy používania hluku pozadia ako prahu pre presné určenie kontaktných bodov.Akékoľvek kvantitatívne výsledky získané matematickým modelovaním a preložením silovej krivky by teda mali byť relatívne presné.
Kvantitatívne merania nanoindentačnými metódami AFM sú úplne závislé od matematických modelov použitých na výber údajov a následnú analýzu.Preto je dôležité pred výberom konkrétneho modelu zvážiť všetky faktory súvisiace s výberom indentoru, materiálovými vlastnosťami a mechanikou ich vzájomného pôsobenia.V tomto prípade bola geometria hrotu starostlivo charakterizovaná pomocou mikrosnímok SEM (obr. 1) a na základe výsledkov je nanoindentačná sonda AFM s priemerom 140 nm s tvrdým kužeľom a guľovou geometriou hrotu dobrou voľbou na charakterizáciu vzoriek lehfilcon A CL79. .Ďalším dôležitým faktorom, ktorý je potrebné starostlivo posúdiť, je elasticita testovaného polymérneho materiálu.Hoci počiatočné údaje o nanoindentácii (obr. 5a a 6a) jasne načrtávajú znaky prekrývania kriviek napätia a stlačenia, tj úplné elastické zotavenie materiálu, je mimoriadne dôležité potvrdiť čisto elastický charakter kontaktov. .Na tento účel sa na rovnakom mieste na povrchu vzorky lehfilcon A CL vykonali dve po sebe nasledujúce vrúbkovanie pri rýchlosti vtláčania 1 um/s za podmienok úplnej hydratácie.Výsledné údaje krivky sily sú znázornené na obr.7 a ako sa očakávalo, krivky expanzie a kompresie oboch výtlačkov sú takmer totožné, čo zvýrazňuje vysokú elasticitu štruktúry rozvetvenej polymérovej kefy.
Dve krivky sily vtlačovania na rovnakom mieste na povrchu lehfilconu A CL naznačujú ideálnu elasticitu povrchu šošovky.
Na základe informácií získaných z SEM a STEM snímok hrotu sondy a povrchu lehfilcon A CL, v tomto poradí, model kužeľovej gule je primeraným matematickým vyjadrením interakcie medzi hrotom sondy AFM a testovaným mäkkým polymérnym materiálom.Okrem toho pre tento model kužeľovej gule platia základné predpoklady o elastických vlastnostiach potlačeného materiálu pre tento nový biomimetický materiál a používajú sa na kvantifikáciu modulu pružnosti.
Po komplexnom vyhodnotení metódy nanoindentácie AFM a jej komponentov, vrátane vlastností indentačnej sondy (tvar, veľkosť a tuhosť pružiny), citlivosti (odhad hluku pozadia a kontaktného bodu) a modelov prispôsobenia údajov (kvantitatívne merania modulu), bola metóda použité.charakterizovať komerčne dostupné ultramäkké vzorky na overenie kvantitatívnych výsledkov.Komerčný polyakrylamidový (PAAM) hydrogél s modulom pružnosti 1 kPa bol testovaný v hydratovaných podmienkach s použitím 140 nm sondy.Podrobnosti o testovaní modulu a výpočtoch sú uvedené v doplnkových informáciách.Výsledky ukázali, že priemerný nameraný modul bol 0,92 kPa a % RSD a percentuálna (%) odchýlka od známeho modulu bola menšia ako 10 %.Tieto výsledky potvrdzujú presnosť a reprodukovateľnosť metódy nanoindentácie AFM použitej v tejto práci na meranie modulov ultramäkkých materiálov.Povrchy vzoriek lehfilcon A CL a základného substrátu SiHy boli ďalej charakterizované pomocou rovnakej nanoindentačnej metódy AFM na štúdium zdanlivého kontaktného modulu ultramäkkého povrchu ako funkcie hĺbky vtlačenia.Krivky oddelenia sily vtlačenia boli vytvorené pre tri vzorky každého typu (n = 3; jeden vtlačok na vzorku) pri sile 300 pN, rýchlosti 1 µm/s a plnej hydratácii.Krivka zdieľania indentačnej sily bola aproximovaná pomocou modelu kužeľ-guľa.Na získanie modulu závislého od hĺbky vtlačenia sa nastavila 40 nm široká časť siločiarovej krivky pri každom prírastku 20 nm počínajúc od bodu kontaktu a namerali sa hodnoty modulu v každom kroku siločiarovej krivky.Spin Cy a kol.Podobný prístup sa použil na charakterizáciu modulového gradientu poly(laurylmetakrylátových) (P12MA) polymérových kefiek pomocou nanoindentácie koloidnou AFM sondou a sú v súlade s údajmi pomocou Hertzovho kontaktného modelu.Tento prístup poskytuje graf zdanlivého modulu kontaktu (kPa) oproti hĺbke vtlačenia (nm), ako je znázornené na obrázku 8, ktorý znázorňuje gradient zdanlivého modulu kontaktu/hĺbky.Vypočítaný modul pružnosti vzorky CL lehfilcon A je v rozsahu 2–3 kPa v rámci horných 100 nm vzorky, za ktorými sa začína s hĺbkou zvyšovať.Na druhej strane, pri testovaní základného substrátu SiHy bez kefovitého filmu na povrchu je maximálna hĺbka vtlačenia dosiahnutá pri sile 300 pN menšia ako 50 nm a hodnota modulu získaná z údajov je približne 400 kPa. , čo je porovnateľné s hodnotami Youngovho modulu pre sypké materiály.
Zdanlivý kontaktný modul (kPa) vs. hĺbka vtlačenia (nm) pre substráty lehfilcon A CL a SiHy pomocou metódy nanoindentácie AFM s geometriou kužeľovej gule na meranie modulu.
Najvyšší povrch novej biomimetickej štruktúry rozvetvenej polymérnej kefy vykazuje extrémne nízky modul pružnosti (2–3 kPa).To sa bude zhodovať s voľne visiacim koncom vidlicovej polymérovej kefy, ako je znázornené na obrázku STEM.Aj keď existujú určité dôkazy o gradiente modulu na vonkajšom okraji CL, hlavný substrát s vysokým modulom má väčší vplyv.Vrchných 100 nm povrchu je však do 20 % celkovej dĺžky rozvetvenej polymérovej kefy, takže je rozumné predpokladať, že namerané hodnoty modulu v tomto rozsahu hĺbky vtlačenia sú relatívne presné a nie sú silné. závisí od účinku spodného objektu.
Vzhľadom na unikátny biomimetický dizajn kontaktných šošoviek lehfilcon A, pozostávajúci z rozvetvených polymérnych kefových štruktúr PMPC navrúbľovaných na povrch SiHy substrátov, je veľmi ťažké spoľahlivo charakterizovať mechanické vlastnosti ich povrchových štruktúr pomocou tradičných metód merania.Tu uvádzame pokročilú metódu nanoindentácie AFM na presnú charakterizáciu ultramäkkých materiálov, ako je lefilcon A s vysokým obsahom vody a extrémne vysokou elasticitou.Táto metóda je založená na použití AFM sondy, ktorej veľkosť hrotu a geometria sú starostlivo zvolené tak, aby zodpovedali štrukturálnym rozmerom ultramäkkých povrchových prvkov, ktoré sa majú otlačiť.Táto kombinácia rozmerov medzi sondou a štruktúrou poskytuje zvýšenú citlivosť, čo nám umožňuje merať nízky modul a inherentné elastické vlastnosti prvkov rozvetvenej polymérovej kefy bez ohľadu na poroelastické efekty.Výsledky ukázali, že unikátne rozvetvené polymérové ​​kefky PMPC charakteristické pre povrch šošovky mali pri testovaní vo vodnom prostredí extrémne nízky modul pružnosti (do 2 kPa) a veľmi vysokú elasticitu (takmer 100 %).Výsledky nanoindentácie AFM nám tiež umožnili charakterizovať zdanlivý kontaktný modul / gradient hĺbky (30 kPa/200 nm) povrchu biomimetickej šošovky.Tento gradient môže byť spôsobený rozdielom modulov medzi rozvetvenými polymérovými kefami a SiHy substrátom alebo rozvetvenou štruktúrou/hustotou polymérnych kefiek, alebo ich kombináciou.Na úplné pochopenie vzťahu medzi štruktúrou a vlastnosťami, najmä vplyvu vetvenia kefy na mechanické vlastnosti, sú však potrebné ďalšie hĺbkové štúdie.Podobné merania môžu pomôcť charakterizovať mechanické vlastnosti povrchu iných ultramäkkých materiálov a zdravotníckych pomôcok.
Súbory údajov generované a/alebo analyzované počas súčasnej štúdie sú dostupné od príslušných autorov na základe primeranej žiadosti.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. a Haugen, HJ Biologické reakcie na fyzikálne a chemické vlastnosti povrchov biomateriálov.Chemický.spoločnosti.Ed.49, 5178 – 5224 (2020).
Chen, FM a Liu, X. Zlepšenie biomateriálov pochádzajúcich z človeka pre tkanivové inžinierstvo.programovanie.polymér.veda.53, 86 (2016).
Sadtler, K. a kol.Návrh, klinická implementácia a imunitná odpoveď biomateriálov v regeneratívnej medicíne.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK a Farr GM Vylepšená metóda na určenie tvrdosti a modulu pružnosti pomocou indentačných experimentov s meraním zaťaženia a posunu.J. Alma mater.zásobná nádrž.7, 1564 – 1583 (2011).
Wally, SM Historické počiatky skúšania tvrdosti vtláčaním.Alma mater.veda.technológií.28, 1028 – 1044 (2012).
Broitman, E. Merania tvrdosti vtlačenia v makro-, mikro- a nanoúrovni: Kritický prehľad.kmeň.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD a Clapperich, SM Chyby detekcie povrchu vedú k nadhodnoteniu modulu pri nanoindentácii mäkkých materiálov.J. Mecha.Správanie.Biomedicínska veda.Alma mater.2, 312-317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR a Yahya M.Yu.Vyhodnotenie metódy nanoindentácie na stanovenie mechanických charakteristík heterogénnych nanokompozitov pomocou experimentálnych a výpočtových metód.veda.Dom 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR a Owart, TS Mechanická charakterizácia mäkkých viskoelastických gélov indentáciou a optimalizáciou založenou na inverznej analýze konečných prvkov.J. Mecha.Správanie.Biomedicínska veda.Alma mater.2, 355-363 (2009).
Andrews JW, Bowen J a Chaneler D. Optimalizácia stanovenia viskoelasticity pomocou kompatibilných meracích systémov.Soft Matter 9, 5581 – 5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. a Pellillo, E. Nanoindentácia polymérnych povrchov.J. Physics.D. Prihlás sa na fyziku.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. a Van Vliet KJ Charakterizácia viskoelastických mechanických vlastností vysoko elastických polymérov a biologických tkanív pomocou nárazovej indentácie.Journal of Biomaterials.71, 388 – 397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Hodnotenie modulu pružnosti a adhéznej práce mäkkých materiálov pomocou rozšírenej Borodich-Galanovovej (BG) metódy a hĺbkovej indentácie.srsť.Alma mater.129, 198 – 213 (2019).
Shi, X. a kol.Morfológia a mechanické vlastnosti biomimetických polymérnych povrchov silikón-hydrogélových kontaktných šošoviek v nanometroch.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).